中文摘要
目的 建立一种应用脱氧胆酸钠沉淀和离子交换色谱技术纯化5型肺炎球菌荚膜多糖的方法。
方法5型肺炎球菌发酵液经离心、超滤、脱氧胆酸钠沉淀处理后，再经过Capto Q离子交换层析，得到精制多糖原液。依据中国药典2020年版三部的相关制检规程对精制多糖原液进行检定分析。
结果 精制多糖原液中蛋白和核酸含量分别不超过3.0%和0.1%，糖醛酸含量不低于18.4%，氨基己糖含量不低于22.7%，各项指标均符合中国药典标准；且多糖回收率达到60.0%以上。
结论 建立的5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺可替代使用乙醇或苯酚的工艺，且操作步骤简便，具有很好的规模工业化应用前景。
正文
肺炎球菌是引起肺炎、中耳炎、脑膜炎及败血症等疾病的主要病原菌之一 [1] 。肺炎球菌性疾病是导致5岁以下儿童及老年人死亡的主要疾病之一。据统计，2015年全球范围内由肺炎球菌感染导致的死亡人数达到151万以上 [2] 。接种疫苗已经成为预防肺炎球菌性疾病最有效的途径之一 [3] 。
荚膜多糖是肺炎球菌的重要毒力因子，也是肺炎球菌多糖疫苗的主要抗原成分。目前，已鉴定的肺炎球菌血清型达到100个 [4] ，用于疫苗生产的血清型仅有24个 [5-6] 。不同血清型荚膜多糖的化学结构、性质各异，纯化方法不尽相同。5型荚膜多糖是应用于肺炎球菌糖类疫苗的重要型别之一，其纯化过程难度大，蛋白杂质含量高，达到5.1%以上 [7] 。传统的肺炎球菌荚膜多糖提取纯化工艺一般采用乙醇、苯酚有机溶剂抽提法 [8-11] 。
本研究目的为建立一种较为简便的5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺，首先采用脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate，DOC）沉淀，然后经离子交换色谱纯化，再经超滤得到5型肺炎球菌精制多糖原液，并进行中试放大试验确认方法的生产适用性。
1
材料与方法
1.1
主要材料与仪器
5型肺炎球菌菌种（编号31457）购自中国医学细菌保藏管理中心；发酵培养基由北京民海生物科技有限公司自制；DOC为分析纯，购自美国Sigma公司；层析填料Capto adhere、Capto DEAE和Capto Q购自美国Cytiva公司。
300 L发酵罐（R2020-62）购自上海高机生物工程有限公司，LYNX6000型高速冷冻离心机购自美国Thermo公司，100 kD超滤膜包（过滤限为相对分子质量100 000）、JMCPSPCONS超滤系统均购自德国Merk Millipore公司，SK-210型pH计购自瑞士Mettler-Toledo公司，AKTA pure-150M层析系统和BPG200/500层析柱均购自美国Cytiva公司，APPS Process DN8生产级全自动蛋白纯化系统购自中国利穂科技(苏州)有限公司。
1.2
实验方法
1.2.1 发酵液超滤 取5型肺炎球菌发酵培养液5 L，0.1% ( m/V ) DOC过夜杀菌，在12 000× g 、4 ℃离心30 min，收集上清液；经100 kD超滤膜包浓缩4~5倍后、再以5倍浓缩液体积的注射用水恒体积洗滤，获得超滤液1。
1.2.2 DOC沉淀法去除蛋白杂质的条件优化 采用正交试验设计L 9 (3 4 )优化筛选DOC沉淀蛋白体系中NaCl浓度、DOC的浓度和pH，各因素水平见表1。沉淀溶液静置3 h后，12 000× g 、4 ℃离心30 min，收集上清液，再将pH调至7.0。若上清液不够清澈，则重复该步骤1~2次，直至完全清澈。上清液经100 kD膜包浓缩4~5倍后、再以5倍浓缩液体积的注射用水恒体积洗滤，获得超滤液2。
1.2.3 层析介质的选择选择3种层析介质比较对中间品多糖溶液中蛋白杂质的去除效果，第1种是复合型阴离子交换层析填料Capto adhere，第2种是弱阴离子交换层析填料Capto DEAE，第3种是强阴离子交换层析填料Capto Q。Capto adhere上样液为50 mmol/L PBS加0.3 mol/L NaCl，pH6.5；Capto DEAE和Capto Q上样液均为50 mmol/L PBS，pH6.5；洗脱液均为50 mmol/L PBS加0.3 mol/L NaCl，pH6.5。上样体积均为10 ml。
1.2.4 Capto Q离子交换层析条件优化超滤液2中加入PBS至终浓度为50 mmol/L、pH7.0后上样；采用正交试验设计L 9 (3 4 )对上样流速、PBS中NaCl浓度和pH进行优化，各因素水平见表2。同步使用示差和紫外两种检测器。
1.2.5 超滤浓缩层析收集的多糖溶液经100 kD膜包超滤浓缩约5倍后，以10倍浓缩液体积的注射用水恒体积洗滤，获得浓缩超滤液即为精制5型肺炎球菌多糖原液。
1.2.6 样品检测参考中国药典2020年版三部（药典三部）及相关文献方法，检测精制多糖分子大小、糖醛酸、氨基己糖、总氮和磷含量 [12] ；用Lowry法测定蛋白含量；260 nm紫外吸收测定核酸含量；免疫浊度法测定多糖含量。DOC残留量检测采用液相色谱串联质谱检测方法 [13] 。
2
结果
2.1
DOC沉淀法去除蛋白杂质的优化结果
DOC对蛋白的沉淀作用受离子浓度、pH等条件的影响较为明显 [14] 。本研究对DOC浓度、NaCl浓度和pH进行了三因素三水平正交优化试验，正交试验设计与结果分析见表3。以沉淀后获得的上清液中蛋白杂质与多糖的比值为评价指标，应用极差分析法进行数据分析。在本试验中， k1、k2、k3 为每个因素各个水平下的评价指标（蛋白多糖比）总和的均值，可以反映各因素不同水平对蛋白杂质去除的影响，该值越低则表明其对应的该水平越利于试验结果；各因素下最大 k 值减去最小 k 值得到极差，可以反映各因素对试验结果的影响幅度，该值越大则表明其对应的该因素对试验结果影响越大。根据极差分析可知，NaCl浓度是对蛋白沉淀最主要的影响因素，其次是pH，而DOC浓度的影响相对较小；由 k 值分析可得出，最优水平组合为0.7 mol/L NaCl、12.0 mmol/L DOC和pH5.0；并对该条件进行了确认试验，所得上清液中蛋白多糖比进一步降低至10.35%，蛋白去除效果良好。
2.2
不同层析介质对多糖纯化的效果
由于5型肺炎球菌荚膜多糖带负电荷，因此试验选择了3种不同的交换层析介质比较其对蛋白、核酸的去除效果及多糖回收率（表4）。经Capto adhere介质层析，多糖主要以流穿模式纯化析出，尽管多糖回收率较Capto DEAE和Capto Q更高，但是蛋白去除效果相对较差；Capto DEAE和Capto Q层析需收集多糖洗脱液，两者多糖回收率相近，但Capto Q对蛋白和核酸杂质的去除效果更为理想（表4）。
2.3
Capto Q离子交换层析条件优化结果
鉴于Capto Q层析介质对多糖纯化的良好效果，试验对上样流速和洗脱条件（NaCl浓度和pH）进行了三因素三水平正交优化试验，正交试验设计与结果分析见表5。以蛋白多糖比为评价指标，通过极差分析可知，洗脱缓冲液中的NaCl浓度为最主要影响因素。根据 k 值得出最优水平组合为上样流速5 ml/min，洗脱液为50 mmol/L PBS加0.2 mol/L NaCl，pH7.0；并对该条件进行了确认试验，所得洗脱液中蛋白多糖比进一步降低至2.58%（表5），核酸多糖比低于0.1%。
2.4
中试放大试验
经上述试验优化后，在优化的DOC沉淀和Capto Q层析条件下（BPG200/500层析柱），进行3批中试放大试验。各项检定结果如表6所示。蛋白含量为2.01%~3.00%，核酸含量均低于0.1%，分配系数（ K D ）在0.37及以下；糖醛酸和氨基己糖含量分别达到18.4%和22.7%及以上，各项质量指标均符合药典三部相关要求。此外，发酵液中荚膜多糖的纯化回收率均不低于60.0%。
3
讨论
肺炎球菌夹膜多糖作为保护性抗原，被用于肺炎球菌疫苗的研发和生产。安全性和有效性是疫苗产品最重要的两个基本属性。肺炎球菌多糖疫苗中蛋白杂质含量是影响安全性的重要因素之一，而特异糖或特异基团决定疫苗的免疫原性，是保证疫苗有效性的前提条件。5型肺炎球菌荚膜多糖是当前23价肺炎多糖疫苗和13价、20价肺炎多糖蛋白结合疫苗的组成型别之一，其精制多糖纯化难度相对较大，蛋白杂质含量普遍较高。依据药典三部，在23价肺炎球菌多糖疫苗的各个型别中，蛋白含量上限最高的亦是5型多糖原液（≤7.5%），而其他大部分型别蛋白含量上限多低于3%，可见降低5型多糖原液中蛋白杂质含量难度之大。
DOC常被用于多糖蛋白结合疫苗中以去除游离的载体蛋白，既能有效去除蛋白质，又能高效回收多糖目标物，上清液中多糖回收率一般在99%以上 [15] 。另有学者探索将其应用于14型肺炎荚膜多糖的纯化，但未进行系统的工艺优化 [16] 。本研究对影响DOC沉淀蛋白的3个主要因素DOC浓度、盐离子浓度和pH进行了正交优化试验，优化后所得超滤液2中蛋白多糖比由229.10%（超滤液1）下降至10.35%，蛋白杂质去除效率达到95.48%，且多糖损失率仅为约5.0%。
为了进一步纯化多糖溶液以符合中国药典要求，根据5型肺炎球菌荚膜多糖带负电荷的性质，选择了3种离子交换层析介质进行试验，最终确定了强阴离子交换层析介质Capto Q具有更佳的纯化效果，并对应用该层析介质的上样条件和洗脱条件进行了正交优化试验。在优化的条件下进行了中试放大试验，得到的精制多糖原液中蛋白含量不超过3.0%，核酸含量低于0.1%，特异糖指标如糖醛酸和氨基己糖含量则分别不低于18.4%和22.7%，多糖分子大小 K D ≤0.37，各项指标均符合药典三部要求；且最终多糖回收率也较高，达到发酵上清液中多糖含量的60.0%以上。而DOC作为外源添加物质，在精制多糖原液中残留量极低，均在8.31 μg/L以下，且可通过增加洗滤倍数进一步降低。
综上所述，本研究确立了应用DOC沉淀和层析技术纯化5型肺炎球菌荚膜多糖工艺，并经中试放大试验确认了该工艺的生产适用性。该工艺不仅避免了使用有毒有害的有机溶剂，而且工艺路线简便，多糖回收率高，获得的精制多糖原液各项指标均能很好的符合药典质量要求，具有很好的规模化应用前景。未来可以尝试将该方法应用于其他型别肺炎球菌荚膜多糖的纯化，进一步扩大该工艺的应用范围。
作者
曹欣 1，2 徐永学 1，2 刘艳丽 1 高志鑫 1 宁云云 1 王元泽 1 王研研 1 郝倩 1 尹珊珊 1 刘建凯 1，2
通信作者：刘建凯，
Email：liujiankai@biominhai.com
引用本文：曹欣，徐永学，刘艳丽，等. 5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺的建立与优化 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(4):200-204. 返回搜狐，查看更多
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