肝脏是一个复杂的器官，由多种细胞类型组成。 其中大部分（60-80%）是实质细胞——肝细胞。 其余细胞形成异质的非实质细胞 (NPC) 群，主要由肝内皮细胞 (LEC)、肝星状细胞 (HSC) 和免疫细胞组成。 肝内免疫细胞是 NPC 最突出的成分（高达 50%），由 T 细胞（CD8+ 和 CD4+）、B 细胞、自然杀伤 (NK) 和自然杀伤T (NKT) 细胞、中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞 (DC) 和巨噬细胞的各种亚型组成。 肝脏免疫细胞的相对组成因生理条件和物种而异，例如，小鼠肝脏中的 NKT 细胞比人类多。 肝脏免疫细胞组成不同于淋巴器官或血液，因为肝脏富含 CD4+ T 细胞、NK、NKT 和 γ δ (γδ) T 细胞。
一般来说，肝脏主要是致耐受性器官，对于预防对饮食和肠道菌群的炎症反应很重要。 因此，NPC 积极促进免疫耐受，例如，肝细胞、枯否细胞 (KC) 和 LEC 诱导 T 细胞无反应。 此外，肝窦LEC (LSEC) 产生称为 LSECtin 的凝集素，可触发 CD8+ T 细胞耐受。 此外，KC 分泌抗炎细胞因子白细胞介素 10 (IL10) ，肝脏驻留的 NK 细胞可通过与免疫检查点通路的相互作用抑制 T 细胞。 在某些病理条件下，例如感染、炎症性疾病或癌症，肝脏免疫细胞的分布或功能可能会发生变化。 这可能导致潜在的不平衡和免疫细胞串扰的改变。
为了更好地了解影响肝脏的各种病理，需要对常驻/浸润性免疫群体进行分离、免疫表型分析和量化。 目标是获得高产量的单细胞悬液，同时仍保留抗原/表位谱（最小表位降解）并为后续下游应用保留细胞活力。为了避免存在于血液中免疫亚群中的肝脏交叉污染，肝脏的原位灌注是通过腔静脉或门静脉进行的。 另一个关键步骤是正确处理肝组织。 组织解离可以通过机械破坏、使用胶原酶的酶消化或两种方法的组合来进行。 对于肝脏免疫细胞表型分析，需要从获得的匀浆中去除肝细胞，因为它们可能会干扰以后的下游免疫分析。 可以通过多个离心步骤或通过 Percoll 或 Iodixanol 密度梯度进一步纯化细胞悬液。 然而，这个过程既费时又费材料。 此外，纯化方法的苛刻条件也可能影响用于任何下游应用的细胞的活力和/或功能。
在此提供一个比较完整的方案和步骤，供各位做小鼠肝脏的FLOWER参考。
方案
小鼠肝脏处理图解
图解工作程序。 (A) 揭开和拉伸门静脉以进行灌注。 (B) 肝灌注。 (C) 渐进式灌注肝脏。 (D) 解离的材料准备。 带有细胞培养基的 C 管，含解离肝脏的酶。 (E) 肝脏与解离混合物一起放入 C 管中。 (F) 解离后的肝脏匀浆。 (G) 分离组织的滤液。 (H) 基于密度梯度的细胞纯化（细胞悬液顶部的碎片去除溶液层；离心前）。 (I) 获得的细胞被残留的红细胞污染。 (J) 去除红细胞后的最终NPC。
单细胞悬液质量评估
获得的单细胞悬液的特征。 (A) 评估细胞活力和总细胞浓度（台盼蓝染色，放大 1 倍和 4 倍）。 绿色圆圈代表活细胞（82%）； 红色圆圈死细胞 (18%)。 1 g 肝组织的总产量为 2.2 × 10E7 个活细胞/mL。 (B) 细胞数量的细胞大小分布。 绿色直方图代表活细胞； 红色直方图代表死细胞。 (C) 细胞浓度的细胞大小分布。 绿色直方图——活细胞； 红色直方图——死细胞。 (D) 细胞簇统计。
多色流式表型分析
分析逻辑：
各类细胞表型：
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