山胡椒根中1个新的倍半萜类成分

山胡椒根为樟科山胡椒属植物山胡椒Lindera glauca(Sieb. et Zucc.) Bl. 的干燥根，又名牛筋条、牛筋树、假死柴、野胡椒等[1]。味辛，大热无毒。具有祛风通络、理气活血的功效，在民间常被用来治疗类风湿性关节炎[2]、心腹痛、跌打损伤[3]等。化学成分研究表明，山胡椒富含挥发油（单萜和倍半萜）、生物碱、黄酮等成分[4-6]；现代药理研究表明其具有抗炎、镇痛、抗肿瘤转移等活性[4]。在前期研究中，课题组从山胡椒根的石油醚部位分离得到了一系列结构新颖、抗炎活性良好的先导化合物，尤其是具有[5, 7, 7]和[5, 7, 6] 元环系骨架的愈创木烷型倍半萜内酯pseudoguaianelactones A～C，其NO抑制活性显著优于阳性药吲哚美辛[7-8]。因此，本研究继续对山胡椒石油醚部位的化学成分进行挖掘，以期从中发现更多具有良好活性的倍半萜类化合物。从中共分离鉴定了10个倍半萜，分别为(4 R ,7 R ,10 S )-4- 羟基-4,10-二甲基-5-羰基-1(6),11(13)-二烯-12-羧酸-萘酮[(4 R ,7 R ,10 S )-4-hydroxy-4,10- dimethyl-5-oxo-1(6),11(13)-dien-12-oic acid- naphthyl ketone，1]、linderaguaianol C（2）、(−)-(4 S ,7 S ,10 S )- 2-oxo-guaia-1(5),11(13)-dien-12-oic acid（3）、一支 蒿酮酸（rupestonic acid，4）、针叶春黄菊酸（aciphyllicacid，5）、xylaguaianol D（6）、β-木香酸（β-costic acid，7）、3 α-hydroxycostic acid （8）、ilicic acid（9）、异一枝蒿酮酸（isorupestonic acid，10）（图1）。其中化合物1为新化合物，命名为一支蒿酮酸M；化合物2为新的天然产物并首次确定了其绝对构型，化合物1～4、6～9为首次从该植物中分离得到。此外，对所有化合物的体外抗炎活性进行了初步评价，其中化合物5～7、9能不同程度地抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的RAW264.7体外细胞炎症模型中NO的释放。

1 仪器与材料

核磁共振波谱仪（400 MHz，德国Bruker公司）；Triple TOF 5600 +高分辨液质联用仪（AB Sciex，加拿大）；圆二色谱仪（Chirascan，英国Applied Photophysics公司）；LC-100半制备高效液相色谱仪（上海伍丰科学仪器有限公司）；Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司）；RV8旋转蒸发仪（IKA，Germany）；TLE204分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Kromasil 100-5 C 18 柱（250 mm×10 mm，5 μm）；多功能酶标仪（美国Thermo公司）；细胞培养箱（ESCO公司，新加坡）；空气净化操作台（海尔生物医疗有限公司）；Motic AE2000型倒置显微镜（厦门麦克奥迪电气股份有限公司）；低速台式离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；移液器（德国Ependoff公司）。

柱层色谱、薄层色谱硅胶（青岛海洋化工分厂）；反相硅胶（YMC*GEL ODS-A-HG 12 nm S-50 µm；日本YMC公司）；羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20，25～100 µm；Fluka BioChemaka，Buchs，瑞士）；甲醇、乙腈（色谱纯，Oceanpak，瑞典）；甲酸（色谱纯，Sigma公司，美国）；石油醚、醋酸乙酯、氯仿、甲醇（分析纯，天津致远试剂公司）；RAW264.7细胞（广州中医药大学周联教授课题组惠赠）；吲哚美辛（批号A0501A，大连美仑生物技术有限公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；Fetal Bovine Serum（美国Gibco公司）；0.25% Trypsin EDTA（美国Gibco公司）；DMSO（细胞级，美国Gibco公司）。

山胡椒药材为本课题组成员采自湖北省巴东县野三关镇黄连坪村林边（东经110.447 0°；北纬30.705 7°；海拔1203 m），由广州中医药大学中药学院彭光天博士鉴定为樟科山胡椒属植物山胡椒L. glauca (Sieb. et Zucc.) Bl. 。标本（ZYXY-IR-2017-05）现存于广州中医药大学药物化学部。

2 提取与分离

山胡椒干燥根20 kg，室温下甲醇渗滤提取，减压回收溶剂得醇提物浸膏2.4 kg，将浸膏用蒸馏水 混悬，加石油醚萃取3次，回收石油醚得萃取物460 g。将石油醚萃取物采用硅胶柱色谱以石油醚-丙酮（含1%二乙胺）系统梯度洗脱（100∶1～2∶1），经过薄层分析合并，得13个流分（Fr. A～M）。

Fr. E过Sephadex LH-20凝胶柱，三氯甲烷-甲 醇（1∶1）洗脱得Fr. E-i，Fr. E-i经半制备高效液相色谱，以甲醇-水（75∶25）洗脱，得化合物2（tR＝9.4 min，30.5 mg）。Fr. I过Sephadex LH-20凝胶柱，用三氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱得Fr. I-c，Fr. I-c过ODC反相柱，40%～80%甲醇梯度洗脱得Fr. I-c-1，继而用半制备高效液相色谱以甲醇-水（50∶50）对其进行纯化，得化合物3（tR＝10.2 min，11.7 mg）和4（tR＝11.5 min，13.4 mg）。Fr. K首先用Sephadex LH-20凝胶柱脱色素，经三氯甲烷-甲醇（1∶1）系统洗脱得Fr. K-b，再将Fr. K-b经正相硅胶柱色谱，以石油醚-醋酸乙酯（9∶1～1∶1）梯度洗脱得Fr. K-b-1～K-b-4，其中Fr. K-b-1经过半制备高效液相色谱以甲醇-含0.1%甲酸水（60∶40）进行制备，得化合物7（tR＝10.6 min，20.3 mg）；组分Fr. K-b-2经ODC反相柱，以40%～80%甲醇梯度洗脱得Fr. K-b-2b和Fr. K-b-2c，再将Fr. K-b-2b进一步经半制备高效液相色谱，以甲醇-含0.1%甲酸水（55∶45）进行制备，得化合物9（tR＝12.2 min，5.7 mg），而Fr. K-b-2c经半制备高效液相色谱，以甲醇-含0.1%甲酸水（58∶42）纯化，得化合物10（tR＝8.1 min，11.1 mg）；最后将Fr. K-b-4经半制备高效液相色谱，以甲醇-含0.1%甲酸水（50∶50）进行制备，得化合物1（tR＝12.7 min，8.3 mg）。将Fr. L经ODC反相柱，以40%～90%甲醇梯度洗脱得Fr. L-c，继而将Fr. L-c经半制备高效液相色谱 以甲醇-含0.1%甲酸水（65∶35）纯化，得化合物6（tR＝8.6 min，9.6 mg）和8（tR＝9.4 min，6.3 mg）。Fr. M经ODC反相柱色谱，以50%～90%甲醇梯度洗脱得Fr. M-b，将Fr. M-b用半制备高效液相色谱 以甲醇-含0.1%甲酸水（70∶30）纯化得化合物5（t R＝10.9 min，8.4 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末（二氯甲烷），10%香草醛浓硫酸显色液喷洒下显黄绿色，易溶于氯仿、甲醇等溶剂。(−)-HRESIMS数据m/ z 263.128 6 [M －H]−（计算值263.128 3，C 15H 19O 4）给出分子式为C 15H 20O 4，计算不饱和度为6；[α] 25 D＋23.5 ( c 0.13 ，MeOH)；(nm):236 (3.32)；圆二色谱特征吸收值为ECD ( c 1.01 mM, MeOH) λ max(Δ ε ) 212 (10.04), 256 ( −6.38), 334 (0.67) nm；(cm −1): 3448, 2927, 2850, 1656, 1639, 1621, 1384, 1118 ，其中在波数3448、2927和1639 cm−1下的特征信号提示结构中含有羟基、甲基和羰基。

从1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) 谱（表1）高场区可观察到1个-CH 3双峰信号δH 1.14 (3H, d, J = 7.2 Hz, CH 3-15) 和1个-CH 3单峰信号δH 1.28 (3H, s, CH 3-14) ；在低场区可观察到2个末端烯质子信号δH5.21 (1H, s, H-13a) 和6.31 (1H, s, H-13b)；另外观察到2个sp 3杂化的次甲基质子信号δH 4.05 (1H, brs, H-7), 2.31 (1H, m, H-10) 和8个sp 3杂化的亚甲基质子信号δH 2.63 (1H, m, H-2a), 2.32 (1H, m, H-2b), 2.15 (1H, m, H-3a), 2.01 (1H, td, J = 12.4, 5.2 Hz, H-3b), 1.71 (2H, m, H-8), 1.70 (1H, m, H-9a), 1.22 (1H, m, H-9b) 。结合13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) 、HSQC和DEPT 135谱分析显示15个碳信号分别对应于1个sp 3杂化的季碳δC 72.4 (C-4)；5个sp 2杂化的季碳（为3个双键季碳δC163.1 (C-1), 130.3 (C-6), 142.4 (C-11) 和2个羰基碳δC 201.3 (C-5), 171.4 (C-12)；2个sp 3杂化的次甲基δC 33.2 (C-7), 36.2 (C-10)；4个sp 3杂化的亚甲基δC 27.9 (C-2), 35.3 (C-3), 25.7 (C-8), 26.4 (C-9)；1个sp 2杂化的亚甲基即末端烯δC 126.5 (C-13)；2个甲基δC 23.9 (C-14), 19.2 (C-15)。

化合物1的1D NMR特征与本课题组前期所报道的化合物rupestonic acid K [8]非常相似，不同的是rupestonic acid K的C-10号位上的羟基在化合物1中变到了C-4号位上。HMBC谱中H-15与C-1/C-10/C-9以及H-14与C-3/C-4/C-5的相关信号证实了以上推论；此外，1H- 1H COSY 谱中所观察到的2个自旋偶合片段H-2/H-3和H-7/H-8/H-9/H-15；HMBC谱 中H-2与C-1/C-6；H-13与C-7/C-11/C-12的相关信号进一步证明了化合物1平面结构的合理性（图2）。

为了确定化合物1的相对构型，对化合物1的NOESY谱图进行分析（图2），在谱图中，NOESY信号H-14和H-15均与Ha-13相关，说明C-4和C-10号位上的甲基朝向一致且都为β构型，因此H-7为α构型。结合生源合成途径，化合物1的绝对构型应该与本课题组前期报道的化合物rupestonic acid J、rupestonic acid K和rupestonic acid I的构型一致[8]，于是采集了化合物1的ECD曲线（图3），结果显示，化合物1与上述已知化合物的ECD吸收曲线完全一致。由此，化合物1的绝对构型被认定为4 R ,7 R ,10 S ，命名为一支蒿酮酸M。

化合物2：淡黄色油膏状物（氯仿），10%硫酸乙醇显亮黄绿色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS m / z 261.149 6 [M－H]-（计算值261.149 1，C 16H 21O 3） 给出分子式为C 16H 22O 3，不饱和度为6。[α]20 D ＋33.7( c 0.194, MeOH) ；(nm):242 (3.08)；ECD ( c 1.38 mmol/L, MeOH) λ max(Δ ε ): 194 (23.60), 219 (−19.87) nm ；1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :1.97 (1H, m, H-3a), 2.60 (1H, m, H-3b), 2.72 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-4), 2.40 (1H, m, H-6a), 2.57 (1H, m, H-6b), 2.58 (1H, m, H-7), 1.88 (2H, m, H 2-8), 1.58 (1H, m, H-9a), 1.77 (1H, m, H-9b), 2.99 (1H, m, H-10), 5.62 (1H, s, H-13a), 6.20 (1H, s, H-13b), 1.08 (3H, d, J = 7.2 Hz, 14-CH 3), 1.00 (3H, d, J = 6.8 Hz, 15-CH 3), 3.76 (3H, s, 12-OCH 3) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 17.6 (C-15), 19.3 (C-14), 26.9 (C-10), 31.1 (C-8), 32.7 (C-9), 37.2 (C-6), 37.9 (C-4), 39.7 (C-7), 43.1 (C-3), 52.1 (-OCH 3), 123.5 (C-13), 145.8 (C-11), 146.3 (C-1), 167.4 (C-12), 176.2 (C-5), 208.2 (C-2) 。通过比对以上信息，发现其与已知结构(−)-(4 S ,7 S ,10 S )-2-oxo-guaia-1(5),11(13)-dien-1 2-oic acid [9]类似，唯一不同的是化合物(−)-(4 S ,7 S ,10 S )-2-oxo-guaia-1(5),11(13)-dien-12-oic acid 中C-12位上的羟基在化合物2中被1个甲氧基（δC 52.1）取代。

该化合物曾被Cheng等[9]以反应中间产物报道了其平面结构。在NOESY谱图中，可以观察到CH 3-14 和CH 3-15 与H-3b的相关信号，H-4与H-7的相关信号，说明CH 3-14 和CH 3-15 共平面，而H-4、H-7与H-10处于共平面。为了进一步确定其绝对构型，采用计算ECD与实验ECD相结合的方法来确定化合物2的绝对构型。首先对化合物2进行构象搜索、优化、激发态展宽、波尔兹曼拟合后，其计算得到的构型为4 S ,7 R ,10 S 的ECD曲线与实验的ECD曲线显示出很好的吻合性（图4），从而确定了2的绝对构型是4 S ,7 R ,10 S 。因此这是该化合物首次从天然产物中分离得到并完整报道了其波谱数据，将其命名为linderaguaianol C。

化合物3：透明油状物（氯仿），10%香草醛浓硫酸显色液喷洒下显浅黄色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 247.133 6 [M －H]−（计算值247.133 4，C 15H 19O 3）给出分子式为C 15H 20O 3，计算不饱和度为6。1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :1.98 (1H, d, J = 18.8 Hz, H-3a), 2.61 (1H, m, H-3b), 2.75 (1H, m, H-4), 2.45 (1H, m, H-6a), 2.60 (1H, m, H-6b), 2.61 (1H, m, H-7), 1.84 (1H, m, H-8a), 1.92 (1H, m, H-8b), 1.59 (1H, m, H-9a), 1.79 (1H, m, H-9b), 3.01 (1H, m, H-10), 5.75 (1H, s, H-13a), 6.38 (1H, s, H-13b), 1.11 (3H, d, J = 6.8 Hz, 14-CH 3), 1.02 (3H, d, J = 7.2 Hz, 15-CH 3) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 17.6 (C-15), 19.2 (C-14), 26.8 (C-10), 31.0 (C-8), 32.7 (C-9), 37.1 (C-6), 38.0 (C-4), 39.3 (C-7), 43.0 (C-3), 125.5 (C-13), 145.7 (C-11), 145.8 (C-1), 171.4 (C-12), 176.9 (C-5), 208.8 (C-2) 。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴 定化合物3为(−)-(4 S ,7 S ,10 S )-2-oxo-guaia-1(5), 11(13)- dien-12-oic acid。

化合物4：透明晶体（氯仿），10%香草醛浓硫酸溶液喷洒下显亮黄色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 247.134 6 [M －H]−（计算值247.133 4，C 15H 19O 3）给出分子式为C 15H 20O 3，计算不饱和度为6。1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :3.19 (1H, m, H-1), 1.83 (1H, m, H-2a), 2.50 (1H, m, H-2b), 2.05 (1H, m, H-6a), 2.62 (1H, m, H-6b), 1.80 (1H, m, H-7), 1.68 (1H, m, H-8a), 1.82 (1H, m, H-8b), 1.84 (1H, m, H-9 a), 2.92 (1H, m, H-9b), 2.15 (1H, m, H-10), 5.75 (1H, s, H-13a), 6.38 (1H, s, H-13b), 0.66 (3H, d, J = 7.0 Hz, CH 3-14), 1.64 (3H, s, CH 3-15) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 8.2 (C-14), 12.3 (C-15), 31.7 (C-8), 35.4 (C-10), 36.7 (C-9), 37.8 (C-7), 38.5 (C-2), 41.5 (C-6), 46.1 (C-1), 125.7 (C-13), 138.0 (C-4), 145.8 (C-11), 171.6 (C-12), 174.7 (C-5), 208.7 (C-3) 。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物4为一支蒿酮酸[10]。

化合物5：淡黄色油状液体（二氯甲烷），10%香草醛浓硫酸显蓝紫色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 233.152 3 [M －H]−（计算值233.154 2，C 15H 21O 2）给出分子式为C 15H 22O 2，计算不饱和度为5。1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :2.70 (1H, t, J = 10.4 Hz, H-1), 1.32 (1H, m, H-2a), 2.04 (1H, m, H-2b), 1.50 (2H, m, H 2-3), 2.00 (1H, m, H-6a), 2.16 (1H, m, H-6b), 3.00 (1H, brs, H-7), 2.15 (1H, m, H-8a), 2.60 (1H, m, H-8b), 2.20 (1H, m, H-9a), 2.48 (1H, m, H-9b), 2.12 (1H, m, H-10), 5.66 (1H, s, H-13a), 6.28 (1H, s, H-13b), 1.56 (3H, s, 14-CH 3), 0.76 (3H, d, J = 6.8 Hz, 15-CH 3) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 13.2 (C-14), 14.3 (C-15), 28.6 (C-3), 32.6 (C-2), 35.6 (C-6), 36.9 (C-8), 37.1 (C-10), 37.5 (C-9), 38.6 (C-7), 53.2 (C-1), 124.7 (C-13), 133.1 (C-4), 134.4 (C-5), 147.3 (C-11), 173.0 (C-12) 。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物5为针叶春黄菊酸。

化合物6：淡黄透明油膏状物（氯仿），10%硫酸乙醇显棕红色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 237.186 3 [M －H]−（计算值237.185 5，C 15H 25O 2）给出分子式为C 15H 26O 2，不饱和度为3。1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :2.15 (1H, m, H-2a), 2.28 (1H, m, H-2b), 1.34 (1H, m, H-3a), 1.63 (1H, m, H-3b), 2.05 (1H, m, H-4), 2.39 (1H, m, H-5), 0.80 (1H, m, H-6a), 1.73 (1H, m, H-6b), 1.66 (1H, m, H-7), 1.13 (1H, m, H-8a), 2.04 (1H, m, H-8b), 2.08 (2H, m, H 2-9), 3.45 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-12a), 3.57 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-12b), 1.06 (3H, s, 13-CH 3), 1.64 (3H, s, 14-CH 3), 0.86 (3H, d, J = 6.8 Hz, 15-CH 3) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 15.4 (C-15), 20.3 (C-13), 22.4 (C-14), 26.8 (C-8), 29.0 (C-6), 30.4 (C-2), 33.1 (C-3), 34.9 (C-9), 39.0 (C-4), 46.3 (C-5), 49.6 (C-7), 68.7 (C-12), 75.7 (C-11), 129.2 (C-10), 141 .4 (C-1)。以上信息显示该化合物含有1个愈创木烷倍半萜骨架，与文献报道光谱数据基本一致[12]，故鉴定化合物6为xylaguaianol D。

化合物7：褐色油膏状物（二氯甲烷），10%香草醛浓硫酸显色液喷洒下显深绿色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 233.155 7 [M －H]−（计算值233.154 2，C 15H 21O 2）给出分子式为C 15H 22O 2，计算不饱和度为5。1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :5.69 (1H, s, H-13a), 6.32 (1H, s, H-13b), 0.74 (3H, s, CH 3-14), 4.41 (1H, s, H-15a), 4.71 (1H, s, H-15b) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 16.6 (C-14), 23.6 (C-2), 27.4 (C-6), 30.1 (C-8), 36.0 (C-10), 37.0 (C-9), 39.5 (C-7), 41.2 (C-3), 41.9 (C-1), 50.0 (C-5), 105.6 (C-15), 125.1 (C-13), 145.4 (C-4), 150.7 (C-11), 173.1 (C-12) 。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物7为β-木香酸。

化合物8：白色无定形粉末（氯仿），10%香草醛浓硫酸显色液喷洒下显黄棕色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 249.147 7 [M －H]−（计算值249.149 1，C 15H 21O 3）给出分子式为C 15H 22O 3，不饱和度为5。1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :1.70 (1H, m, H-1a), 1.82 (1H, m, H-1b), 1.54 (1H, m, H-2a), 1.88 (1H, m, H-2b), 4.40 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-3), 1.97 (1H, dd, J = 9.4, 4.0 Hz, H-5), 1.50 (1H, m, H-6a), 1.66 (1H, m, H-6b), 2.50 (1H, m, H-7), 1.38 (1H, m, H-8a), 1.53 (1H, m, H-8b), 1.18 (1H, m, H-9a), 1.53 (1H, m, H-9b), 5.64 (1H, s, H-13a), 6.20 (1H, s, H-13b), 1.09 (3H, s, 14-CH 3), 5.41 (1H, s, H-15a), 5.44 (1H, s, H-15b) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 21.8 (C-14), 26.3 (C-6), 31.6 (C-8), 33.3 (C-2), 34.7 (C-9), 38.7 (C-10), 39.0 (C-1), 40.3 (C-7), 42.8 (C-5), 73.9 (C-3), 107.0 (C-15), 121.3 (C-13), 146.5 (C-11), 153.5 (C-4), 171.6 (C-12) 。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物8为3α-hydroxycostic acid。

化合物9：白色无定形粉末（氯仿），10%香草醛浓硫酸显色液喷洒下显浅黄色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 251.163 3 [M －H]−（计算值251.164 7，C 15H 23O 3）给出分子式为C 15H 24O 3，计算不饱和度为4。1H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :1.63 (1H, m, H-1a), 1.70 (1H, m, H-1b), 1.44 (1H, m, H-2a), 1.68 (1H, m, H-2b), 1.80 (2H, m, H 2-3), 1.45 (1H, m, H-5), 1.90 (1H, m, H-6a), 1.25 (1H, m, H-6b), 2.50 (1H, m, H-7), 1.38 (1H, m, H-8a), 1.54 (1H, m, H-8b), 1.35 (1H, m, H-9a), 1.75 (1H, m, H-9b), 5.60 (1H, s, H-13a), 6.18 (1H, s, H-13b), 0.90 (3H, s, 14-CH 3), 1.11 (3H, s, 15-CH 3) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 19.0 (C-14), 20.0 (C-2), 21.6 (C-15), 26.7 (C-8), 27.1 (C-6), 34.5 (C-10), 39.9 (C-7), 40.8 (C-9), 43.2 (C-1), 44.3 (C-3), 55.0 (C-5), 72.5 (C-4), 124.5 (C-13), 146.0 (C-11), 171.3 (C-12) 。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物9为ilicic acid。

化合物10：无色柱状结晶（氯仿），10%浓硫酸乙醇溶液喷洒下显黄色，易溶于氯仿。(−)-HRESIMS数据m/ z 247.132 8 [M －H]−（计算值247.133 4，C 15H 19O 3）给出分子式为C 15H 20O 3，计算不饱和度为6。1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ :2.02 (1H, m, H-1), 2.10 (1H, m, H-2a), 2.19 (1H, m, H-2b), 2.23 (1H, m, H-3a), 2.56 (1H, m, H-3b), 5.80 (1H, s, H-5), 2.40 (1H, m, H-7a), 2.71 (1H, m, H-7b), 2.58 (1H, m, H-8), 1.58 (4H, m, H 2-9, 10), 1.91 (1H, m, H-11), 5.59 (1H, s, H-14a), 6.25 (1H, s, H-14b), 1.03 (3H, d, J = 6.7 Hz, CH 3-15) ；13C-NMR (100 MHz, CDCl 3) δ : 21.8 (C-15), 27.6 (C-2), 28.3 (C-9), 32.9 (C-10), 33.2 (C-7), 33.3 (C-11), 42.1 (C-8), 44.5 (C-3), 45.8 (C-1), 125.6 (C-14), 127.1 (C-5), 144.7 (C-12), 167.8 (C-6), 171.5 (C-13), 200.3 (C-4) 。通过与文献比对以上信息，其与已知结构异一枝蒿酮酸的光谱数据基本一致，该结构与本研究中报道的倍半萜类结构生源途径不吻合，其含有比较少见的[6, 7] 元环骨架，其在1991年时被徐广顺等[16]通过X-射线单晶衍射实验确定了其平面以及立体构型。综合上述分析，鉴定化合物10为异一枝蒿酮酸。

4 化合物的抗炎活性

本研究采用LPS诱导RAW264.7细胞建立体外细胞炎症模型对化合物活性进行测试，细胞培养和体外NO测定参照本课题组先前报道的方法[7-8]。细胞培养在DMEM完全培养液中[含10%胎牛血清（FBS）＋青霉素（60 units/mL）＋链霉素（100 μg/mL）]，实验时接种对数生长期细胞每孔2×10 4个细胞于96孔板中，在37 ℃和5% CO 2的细胞培养箱中贴壁生长24 h。预先将测试化合物和阳性药吲哚美辛用完全培养液稀释至25 μmol/L，加入96孔板预作用2 h，然后加入1 μg/mL LPS培养48 h。NO测试选择Griess法[17]，先吸取100 μL细胞上清液，在室温下先加入50 μL Griess试剂A，再加入50 μL Griess试剂B，室温下振摇均匀。将上述反应液用酶标仪测定540 nm下吸光度（A）。同样方法下选择亚硝酸钠为标准品制作标准曲线，计算NO浓度，进而计算各化合物对RAW264.7细胞NO释放的抑制率。

细胞抑制率＝1－( A 药物－A调零)/( A 对照－A调零)

结果如表2所示，在25 μmol/L浓度下，化合物5～7、9对LPS刺激的RAW264.7细胞中NO释放显示出与阳性药相当的抑制活性，抑制率为24.34%～27.06%，阳性药吲哚美辛抑制率为38.16%。

5 讨论

本实验在前期研究的基础上，综合应用系列化学手段对山胡椒低极性部位的倍半萜成分进行挖掘，从中共分离鉴定了10个倍半萜类成分，其中化合物1为1个新的萘型倍半萜，化合物2为首次从天然产物中分离得到并通过ECD量子化学计算确定了其绝对构型。倍半萜是自然界广泛存在的一类 分子结构，其由3个异戊二烯单元组成，且具有[6, 6] 二元环、[5, 7] 二元环、[6, 6, 3] 三元环等多种环系骨架[18]。正是由于倍半萜复杂多样的分子结构类型，使得倍半萜类成分具有诸如抗炎[19]、抗肿瘤[20]、抗疟[21]、神经保护[22]等广泛的生物活性，吸引着一大批药物化学家的关注。鉴于山胡椒具有治疗类风湿性关节炎的作用，本研究对所有分离得到的化合物进行了初步抗炎活性评价，结果表明化合物5～7、9对LPS诱导的RAW264.7体外细胞炎症模型中NO的释放具有较强的抑制活性。从构效关系上来看，其抗炎活性可能与骨架类型、环上是否具有羰基官能团以及部分手性中心的构型有关。总之，本研究的开展，不仅丰富了山胡椒及山胡椒属植物的化学成分库，还为山胡椒的药效物质基础及作用机制研究提供了思路和研究材料，同时也寻找到了一个挖掘倍半萜活性先导化合物的宝贵来源。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：阮清锋，卢淇平，幸丹霞，崔 辉，赵钟祥．山胡椒根中1个新的倍半萜类成分 [J]. 中草药, 2023, 54(2):457-464.返回搜狐，查看更多