虎耳草Saxifraga stolonifera Curt属虎耳草科虎耳草属多年生草本药用植物，其作为一种常用中药可全草入药，性微苦、辛、寒，具有祛风清热，凉血解毒等功效，可用于治疗风疹、湿疹、中耳炎、丹毒、肺痈、痔疾等症[1-2]。已有研究表明虎耳草含有异香豆精类、酚酸类、萜类和黄酮类等多种化合物，具有抑菌、抗炎、抗氧化、保肝、抗肿瘤等药理活性。例如卢玉栋等[3]发现虎耳草提取物在体外具有良好的抑菌和抗氧化作用。Ji等[4]从虎耳草药草中分离得到岩白菜素，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激和神经保护的特性，可通过激活人磷脂酰肌醇三羟基激酶/苏氨酸蛋白激酶信号通路改善1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶 （1-methyl-4-phenyl- 1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）诱发的帕金森氏病。然而，一方面由于人们滥挖乱采，虎耳草野生资源越来越少，难以满足制药对药源的要求[5]，另一方面虎耳草在各地区栽培所产的活性提取成分含量及作用效果等存在较大差异从而对后续利用造成了不便[6-7]，因此寻找虎耳草药用资源更稳定有效、可持续的替代利用途径显得十分必要。
植物内生菌是指定殖在植物组织内部的微生物群落，它们存在于植物发育的不同阶段，且不会对宿主植物产生损害或者感染，包括植物内生真菌、细菌和放线菌[8]。研究表明，植物内生真菌能产生多种结构类型的代谢产物，包括生物碱、芳香类、多肽类、萜类、酚类和黄酮类等成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫抑制剂和抗癌等多种生物学活性[9-10]，其中很多内生真菌的代谢产物具有植物宿主提取物相同或相似的结构或活性，如贺鹏飞[11]从中药乌头中分离得到的内生菌中发现其次生代谢产物中含有乌头碱，为乌头碱的获得提供了微生物来源；苏秀丽等[12]从中药植物黄花倒水莲内生真菌中发现一株链格孢属HNLF-44菌株具有良好的抑菌和抗氧化活性，与前人对宿主植物化学成分和药理活性所做的研究结果相符，因此内生真菌是探寻新型活性物质的重要新资源，也为药用植物资源的持续利用和保护提供了替代途径。全面了解药用植物内生真菌的类群与多样性信息是充分挖掘和利用植物内生真菌资源的前提。近年来，高通量测序技术可直接在宿主组织内检测内生真菌，具有测序基数大、深度高等优点，能更加全面直观地分析植物组织内生真菌多样性[13]，有研究者利用高通量测序技术分析了朝鲜淫羊藿叶[14]、百合[15]的内生真菌群落多样性，获得了大量的内生真菌类群信息，为后续药用植物内生真菌的分离和利用奠定了基础。目前大量研究证实虎耳草提取物具有良好的抗氧化活性[7,16]，但关于虎耳草的内生真菌生物多样性及其抗氧化活性的研究未见报道。因此本研究拟结合高通量测序和传统可培养技术对虎耳草内生真菌的多样性进行系统分析，并对其代谢产物的抗氧化活性进行筛选，从而为虎耳草内生真菌资源的后续利用奠定了基础，也为微生物来源的天然抗氧化剂筛选提供菌种资源，同时为解决虎耳草资源紧缺提供了替代利用途径。
1 材料与仪器
1.1材料
供试植株为新鲜、健康（无明显病症）的虎耳草，于2021年7月7日采集自湖南省张家界慈利县（29°23′90.2N，111°07′77.6E），株高约16 cm，经华南植物园陈贻竹研究员鉴定为虎耳草S. stoloniferaCurt。将植株完整采摘后送至实验室并于4 ℃冰箱保存备用。
1.2主要试剂及仪器设备
高效植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；真菌DNA小量提取试剂盒，Magen公司；引物（ITS1和ITS4），生工生物工程（上海）有限公司；马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）和液体培养基（PDB），广东环凯生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH），购自Sigma公司；抗坏血酸（Vc）、水杨酸、硫酸亚铁、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、过硫酸钾为分析纯，上海麦克林有限公司；SW-CJ-1F型单面双人洁净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；ETC811基因扩增仪，北京东胜创新生物科技有限公司；JY-C电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；SpectraMax i3x酶标仪，MD美谷分子公司。
2 方法
2.1虎耳草植株样品的表面消毒
将新鲜健康虎耳草植株在流水下冲洗以去除土壤颗粒等表面杂质，用无菌剪刀剪切至适量大小，无菌水清洗3～5遍并用无菌滤纸吸干，依次在75%的酒精中浸泡1 min，含3%～5%有效氯的NaClO溶液中浸泡根部1 min、茎部2 min、叶部1.5 min，再用75%酒精浸泡30 s，最后用无菌水漂洗3遍，并收集最后一次漂洗样品的无菌蒸馏水，经平板涂布检查无菌后进行后续实验，样品则静置于无菌滤纸上吸去多余水分，晾干。
2.2虎耳草植株总DNA的提取及PCR扩增
将按“2.1”项消毒好的虎耳草不同部位通过高效提取试剂盒提取样品基因组总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳法对提取的DNA纯度及浓度进行验证，确认合格后送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行检测。
2.3高通量测序及数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后进行拼接、过滤、质量控制、与物种注释数据库进行比对检测并去除嵌合体序列，最终得到有效数据。以97%的一致性[17]将聚类成为可操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs），用Qiime软件（V 1.9.1）对OTUs中出现频数最高的序列进行物种注释分析[18]，并分别在门纲目科属种各个分类水平统计各样本的群落组成。使用MUSCLE（V 3.8.31）软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系，再对各样本的数据进行均一化处理后进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析，最后使用R软件（V 2.15.3）绘制稀释曲线，Rank abundance曲线等。
2.4虎耳草内生真菌可分离培养、纯化及其多样性分析
将虎耳草植株按“2.1”项步骤进行表面消毒验证无菌后，采用文献[19]中的组织块分离法进行虎耳草内生真菌的分离，将晾干后的样品剪切至适当小片，接种至PDA培养板在28 ℃下培养1～2周，每日观察，若有菌丝从植物组织切口长出，及时挑出转移至新的平板上，纯化培养后接种至斜面培养基，4 ℃保存备用。参考文献[20-22]中的方法根据菌落的菌丝和孢子等形态学特征及ITS测序进行内生真菌的分类鉴定。然后，按照真菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取真菌DNA，引物为ITS1和ITS4，再将经琼脂糖凝胶电泳检测合格后的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定，利用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）在GenBank中获取与鉴定菌株序列相似的相似序列信息。
2.5虎耳草内生真菌抗氧化活性菌株筛选
选取虎耳草不同部位代表性菌株进行DPPH、OH和ABTS自由基抗氧化活性筛选。接种适量菌饼至PDB培养基中，28 ℃、180 r/min培养5～7 d，然后将发酵液依次通过纱布、滤纸进行滤过，再用0.22 μm微孔滤膜对发酵液进行过滤除菌，收集得到内生真菌发酵液，于4 ℃冰箱保存备用。
参考Subbiah等[23]的方法并加以改进后进行测定。采用无水乙醇溶液将DPPH配制成0.05～0.1 mmol/L的溶液。以Vc为阳性对照，在96孔板中分别以A x为100 μL不同内生真菌发酵液或者阳性对照品与100 μL的DPPH混合溶液，Ac为100 μL内生真菌发酵液与100 μL的无水乙醇溶液混合，A0取100 μL无水乙醇溶液与100 μL的DPPH溶液，即以无水乙醇作空白对照，震荡摇匀，在25 ℃避光反应30 min，最后在517 nm下检测A值，每个样品平行测3次，DPPH自由基清除率计算如公式（1）所示。
DPPH自由基清除率＝1－( A x－Ac)/ A 0（1）
OH自由基测定采用水杨酸法，参照文献中Hu等[24]的方法并加以改进后进行测定。称量试剂，配制0.1%的H 2O 2溶液，浓度为6 mmol/L的FeSO 4溶液和水杨酸乙醇溶液。以Vc为阳性对照，在96孔板中依次加入6 mmol/L的FeSO 4溶液、水杨酸乙醇溶液各50 μL，不同内生真菌发酵液或者阳性对照品50 μL，然后加入0.1%的H 2O 2溶液50 μL混合均匀，设为B x，其中，对照管Bc以B x为基础，用无水乙醇替代水杨酸乙醇溶液，B0以B x为基础，用无菌蒸馏水替代内生真菌发酵液，总体积为200 μL，摇匀后在37 ℃下孵育30 min，510 nm处测定A值，每组实验平行操作测定3次，OH自由基清除率计算见公式（2）。
OH自由基清除率=1－( B x－Bc)/ B 0（2）
参考文献中Zou等[25]方法并加以改进后进行测定。首先，配制ABTS溶液，将7 mmol/L ABTS和140 mmol/L过硫酸钾溶液混合制备ABTS储备溶液，在黑暗环境中孵育16 h，再用无水乙醇溶液将其在734 nm下的A值调整至0.70±0.02。以Vc为阳性对照，在96孔板中加入50 μL的不同内生真菌发酵液或者阳性对照品（Y x）和200 μL ABTS溶液（Y c），混合摇匀10 s以充分混合，避光静置6 min，用无水乙醇作为空白对照（Y 0），在734 nm波长下检测A值，每个样品平行测3次，ABTS自由基清除率计算见公式（3）。
ABTS自由基清除率＝1－( Y x－Yc)/ Y 0（3）
2.6数据分析
虎耳草内生真菌的定殖率（colonization rate，CR）、分离率（isolation frequency，IF）、相对分离频率（relative frequency，RF）、Shannon-Wiener多样性指数（H′）、均匀度指数（E）以及相似性指数（Cs）参考孟祥才等[26]的方法进行计算，不同部位间采用Duncan′s多重比较法进行分析，统计显著水平为P＜0.05。
3 结果与分析
3.1高通量测序分析真菌多样性分析
3.1.1虎耳草高通量测序样本数据统计与Alpha多样性分析利用Illumina高通量测序技术，从虎耳草根、茎、叶3个部位的样品中共得到有效序列660 231条，其中根部244 780条，茎部188 596条，叶部226 855条（表1）。基于97%的有效性进行OTU聚类分析从根、茎、叶分别获得507、377、550个OTUs（图1）。样品的稀释曲线显示其随着测序数量的增加趋向平坦（图2），且3个部位的OTU覆盖指数均为1（表1），这表明测序结果能够较好地反映虎耳草各部位间微生物的真实情况。叶部的Chao1和ACE指数最高，其次为根部，茎部最低，这表明虎耳草叶部的内生真菌物种丰富度最高，而茎部最低。根部的Shannon和Simpson指数要明显高于茎部和叶部，这表明虎耳草根部的内生真菌物种多样性最高，而茎部和叶部之间差异不大（表1）。虎耳草的根、茎、叶3部位共有的OTU为96个，根部和茎部之间共有194个OTU，茎部与叶部共有130个OTU，叶部与根部之间共有158个OTU，其中根部和茎部之间共有OTU数量最多，这表明这2个部位含有较多相似或是相同的物种（图1）。
3.1.2虎耳草高通量测序分析内生真菌的群落组成分析基于高通量测序分析，虎耳草内生真菌隶属于11门、45纲、100目、205科和347属。在门的分类水平上（图3-a），子囊菌门（Ascomycota）是虎耳草根（84.81%）、茎（39.82%）、叶（27.09%）的共有优势菌门，其次为担子菌门（Basidiomycota），分别占根、茎、叶的8.97%、7.23%和7.43%。在纲分类水平上，虎耳草根部的主要类群有粪壳菌纲（Sordariomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）和伞菌纲（Agaricomycetes），分别占比49.14%、19.39%、11.18%和8.74%；茎部中粪壳菌纲（24.41%）、座囊菌纲（Dothideomycetes，7.66%）和散囊菌纲（5.19%）的相对丰富较高，而在叶部的主要类群为粪壳菌纲、座囊菌纲和节担菌纲（Wallemiomycetes），分别占15.73%、4.74%和4.46%（图3-b）。在目分类水平上，虎耳草根部优势类群为肉座菌目（Hypocreales，26 .84%）和柔膜菌目（Helotiales，18.69%）；茎部为粪壳菌目（Sordariales）、肉座菌目和格孢腔菌目（Pleosporales），分别占比为10.75%、7.16%和6.76%；另外，肉座菌目（6.98%）、Glomerellales（6.69%）和节担菌目（Wallemiales，4.46%）是叶部的优势类群（图3-c）。在科分类水平上，赤壳科（Nectriaceae）为虎耳草根、茎、叶的共同优势菌科，分别占26.19%、9.69%、6.88%（图3-d）。在属分类水平上，Dactylonectria、Minimelanolocus和Mycoleptodiscus为根部优势菌属，分别占比15.68%、7.23%和6.03%；茎部的优势菌属为Humicola（9.57%）、链格孢属Alternaria（4.15%）和Minimelanolocus（2.13%）；炭疽菌属Colletotrichum、丽赤壳菌属Calonectria和Wallemia属为叶部优势菌属，分别占比5.33%、4.63%和4.46%（图4-b）。
3.2基于可培养方法的内生真菌多样性分析
3.2.1虎耳草内生真菌的分离率和定殖率表面消毒最后一次漂洗用无菌水经平板涂布培养7 d后，检查无菌生长，这表明分离得到的菌株均属虎耳草的内生真菌。从430块虎耳草不同部位组织块中共分离得到381株内生真菌，其中根部103株，茎部136株，叶部142株（表2）。虎耳草叶、根、茎部内生真菌的定殖率分别为89.33%、79.23%和78.63%，其内生真菌分离率分别为94.67%、90.67%和79.23%，3个部位中叶部内生真菌的分离率和定殖率均为最高（表2）。
3.2.2虎耳草内生真菌的类群组成利用组织分离法共从虎耳草分离到381株内生真菌，经形态学鉴定和ITS-rDNA序列分析，其属于31个属，其主要类群为炭疽菌属（19.42%）、篮状菌属（Talaromyces，10.76%）、曲霉菌（Aspergillus，8.66%）、青霉菌属Penicillium（7.87%）、丽赤壳属（7.61%）和间座壳属Diaporthe（7.35%）（表3）。虎耳草内生真菌不同部位之间内生真菌类群组成存在一定差异：根部内生真菌有20个属，其优势菌属为炭疽菌属、篮状菌属和Dactylonectria，相对分离频率分别为10.68%、10.68%和9.71%；茎部共分离得到12个属，优势属为炭疽菌属（15.44%）、篮状菌属（12.50%）、间座壳属（11.76%）和曲霉菌（11.03%）；另外，叶部分离到12个属，炭疽菌属（29.58%）、丽赤壳属（11.97%）和青霉菌属（10.56%）为主要类群。
3.2.3虎耳草不同部位内生真菌的多样性和相似性比较虎耳草内生真菌的H′为3.01，其中根部H′值最高（2.81），其次是茎部（2.36），叶部（2.18）最低。虎耳草茎部（0.95）和根部（0.94）的内生真菌均匀度指数明显高于叶部（0.88）（P＜0.05）。茎部与叶部、根部与茎部、根部与叶部之间的内生真菌组成的相似性指数介于0.25～0.50，均为中等不相似（表4）。
3.3 虎耳草内生真菌抗氧化菌株筛选结果
挑选出24株代表性内生真菌菌株，其分子鉴定结果见表5，并对它们的抗氧化活性进行了筛选，结果发现，DPPH自由基清除率大于50%的菌株有22株，占测试菌株的91.67%，高于80%的菌株有4株（占16.67%），分别为Cylindrocladiellasp. HECR12、Talaromycessp. HECS10、Phyllostictasp. HECL35和Fusariumsp. HECS27，其中菌株Fusariumsp. HECS27（91.67%）的清除率最高；OH自由基清除率大于50%的菌株有19株（占79.17%），高于80%的菌株有Fusariumsp. HECS27和Colletotrichumsp. HECL23，其中菌株Colletotrichumsp. HECL23的清除率（98.88%）高于阳性对照组（Vc），具有很强的OH清除能力；ABTS自由基清除率大于50%的有20株，占测试菌株的83.33%，其中高于80%的有Penicilliumsp. HECS30和Aspergillussp. HECS31，其清除率为别为81.27%和88.70%。菌株Fusariumsp. HECS27对DPPH、OH自由基清除率均高于80%，菌株Talaromycessp. HECS10对DPPH、OH、ABTS 3种自由基的清除率均高于75%（表6）。
4 讨论
药用植物具有丰富的内生菌资源[26]，对其群落结构及多样性进行分析，进而指导筛选功能性菌株可以更好地实现药用植物资源可持续利用，也为药用微生物资源的开发提供更可靠的菌种信息。本研究采用Illumina Miseq高通量测序技术并结合传统培养方法对中药虎耳草植株进行了内生真菌类群结构及多样性分析。基于Illumina Miseq高通量测序共从虎耳草检测出347属的内生真菌，明显高于可培养分离得到的31个属，这说明高通量测序技术获得内生真菌类群和多样性信息更为丰富和全面。高通量测序结果显示虎耳草根、茎、叶3个部位中的优势菌门为子囊菌门和担子菌门，这与青海云杉针叶内生真菌类群相似[27]。另外，其优势菌属有Dactylonectria、Minimelanolocus、Mycoleptodiscus、Humicola、链格孢属、Wallemia、炭疽菌属和丽赤壳菌属等，其中链格孢属、炭疽菌属在其他植物内生真菌中也较为常见[28-19]。组织分离法得到的相对丰度较高优势菌属如炭疽菌属、Dactylonectria和丽赤壳菌属均在高通量测序中检测到，但存在一部分类群在高通量测序中并不是优势菌，这可能与其在分离培养基中更易生长有关[31]。虎耳草内生真菌基于高通量分析的α多样性Shannon指数（根5.16、茎2.96、叶2.88）与基于可培养方法分析的Shannon-Wiener指数（总体多样性3.01）均高于多数已报道的其他药用植物[27,31-32]，这表明虎耳草蕴含较为丰富的内生真菌资源，这可能与植物的类型及其特定的生存环境、气候条件等因素有关[33]。高通量测序分析和组织分离法均发现虎耳草根部内生真菌多样性明显高于茎部和叶部，这可能与根部长期接触蕴含丰富微生物资源的土壤有关[34]。结合高通量测序和传统可培养技术可以获得较为全面的虎耳草内生真菌群落信息和菌株资源，这为虎耳草内生真菌药用资源的后续开发与利用奠定了基础[35]。
当前，氧化应激已被证明在许多情况下会加速疾病的发展，包括糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默症和帕金森症、急性肺损伤、放射性损伤、癌症，甚至衰老等[36]。几乎所有生物体都存在内源性抗氧化防御和修复系统以防止机体氧化损伤，但这些系统通常不足以完全防止损伤[37]。因此，寻找天然抗氧化剂以减少机体的氧化损伤在食品工程和医药等领域都具有重要的应用价值。现有研究表明虎耳草具有良好的抗氧化活性，关于虎耳草内生真菌的抗氧化活性未见报道。本研究对24株虎耳草内生真菌代表性菌株发酵液进行DPPH、OH和ABTS自由基抗氧化活性筛选，结果显示受测试菌株均具有不同程度的抗氧化活性，其中对DPPH、OH和ABTS自由基具有50%以上活性的菌株分别占受测总数的91.67%、79.17%和83.33%。菌株Fusariumsp. HECS27对DPPH（91.67%）和OH自由基（86.57%）都具有较高的清除活性，菌株Colletotrichumsp. HECL23对OH自由基的清除率达到98.88%；菌株Penicilliumsp. HECS30（81.27%）和Aspergillussp. HECS31（88.70%）对ABTS自由基具有很好的清除效果，而菌株Talaromycessp. HECS10对DPPH、OH和ABTS 3种自由基的清除率均高于75%。以上结果表明虎耳草内生真菌中蕴含中丰富的具抗氧化活性的菌株，它们为筛选微生物来源的天然抗氧化剂提供重要资源库，也为虎耳草药用资源的可持续利用提供了替代途径，其中活性优良菌株有待于后续进一步深入研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：陈美琪，王 兴，黎俊彦，谭绮雯，李鉴滨，姚华雄，张玉鑫，谢思韵，邓祖军．基于高通量测序和组织分离法的虎耳草内生真菌多样性分析及其抗氧化活性研究 [J]. 中草药, 2023, 54(6):1924-1934.返回搜狐，查看更多