【背景】
急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）是一个严重的健康问题，会导致严重的发病率和死亡率。炎症是急性肺损伤发病机制中的一个重要因素。尽管使用传统的中药黄连解毒汤（HLD）已经成功地控制了急性肺损伤，但其作用机制仍不清楚。
2022年12月发表在Phytomedicine上的题为“Inhibition of inflammasome activation via sphingolipid pathway in acute lung injury by Huanglian Jiedu decoction: An integrative pharmacology approach”的论文，通过大鼠体内实验，发现HLD能给通过平衡脂质代谢、能量代谢和氨基酸代谢，调节鞘脂途径抑制NLRP3炎症小体活化，从而改善ALI症状。
【研究对象】
大鼠，实验验证队列（6组，n=16），关键通路验证队列（4组，n=5）
【技术方法】
转录组，代谢组，ELISA，HE，免疫组化，qRT-PCR
【实验路线】
【研究结果】
- HLD有效成分和药效的鉴定
通过指纹图谱分析，与对照品对应，色谱峰1-8分别为黄酮、黄芩苷、黄连碱、黄连素、小檗碱、巴丁碱、黄芩苷、黄芩苷(图1A-B)。实验组小鼠被分为六组，对照组Con，模型组LPS，中、低、高浓度组HL、HM和HH，以及阳性药物对照组DEX。肺组织的HE染色结果显示，LPS引起明显的组织改变，在给予DEX和HLD后，肺部的病理改变有所改善，被LPS诱导的评价肺水肿和微血管通透性的重要参数W/D、MPO活性和BALF蛋白浓度的改变，在给药之后也均有所回复（图1C-F）。
这些结果表明，HLD对LPS引起的肺泡-血管屏障的完整性、肺部水肿和细胞损伤有明显的保护作用。
图1 HLD对LPS诱导的ALI有保护作用
- HLD减弱了LPS诱导的ALI的炎症反应
ALI被诱导发生后，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高。作者从大鼠中提取肺泡灌洗液BALF、血清和肺组织，并检测了促炎细胞因子的水平。结果显示，LPS组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显升高，HLD降低了炎症因子的水平(图2A-I)，这表明HLD对ALI具有显著的抗炎作用。
图2 HLD降低了LPS诱导的ALI中的炎症反应
- 利用网络药理学预测了HLD在ALI中的潜在机制
作者从数据库中收集了43个化合物和408个疾病靶标，使用交叉分析确定了74个潜在的用于ALI治疗的HLD蛋白，并进行了GO分析。结果显示，这些靶点参与了生物过程，如炎症反应、细胞对缺氧的反应和基因表达的正向调节；细胞成分主要富集在质膜、细胞表面和细胞外空间；在分子功能方面，这些靶点主要涉及蛋白质异构化活性、蛋白质同构化活性和酶结合。KEGG的结果表明，这些靶点与 "HIF-1信号通路"、"TNF信号通路"、"FoxO信号通路 "和 "Sphingolipid信号通路 "密切相关。（图3A-C）结合文献分析，作者得到了每种中药中与疾病最相关的活性成分，并进行了靶向通路富集分析（图3D ）。
图3 HLD治疗ALI的潜在机制预测
- HLD治疗ALI后的转录组分析
PCA结果显示，Con组、LPS组和HH组之间的全局转录水平有明显区别，分别有3055个和2542个差异基因（图4A-D）。为了确定受影响的途径，根据差异基因进行了KEGG富集，如图所示，LPS与HH的黄色板块（代谢）明显增加，这表明HLD对ALI大鼠生物功能的改变可能集中在代谢物上（图4E-F）。此外，选择 "信号通路 "作为关键词时，得出了前18条重要的信号通路（图4G），如PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路和TNF信号通路。
上述结果表明，HLD可能会影响这些途径并改善大鼠的ALI症状。
图4 HLD处理ALI大鼠的转录组分析
- HLD治疗ALI后的代谢组分析
对肺组织样本进行NMR代谢分析后，鉴定出34种代谢物，主要是氨基酸、脂质和碳水化合物代谢物（图5A）。PCA结果表明，HH组结果更偏向con组，表明HLD能够改善ALI的代谢紊乱（图5B-C），HLD治疗后，许多代谢物表现出明显的逆转趋势，包括乙醇胺、甘氨酸、鞘氨醇、乳酸、磷酸乙醇胺、磷胆碱，这暗示了HLD通过调节这些代谢物的表达来发挥抗炎作用（图5D）。进一步分析代谢途径后，作者发现这些途径主要涉及脂质代谢、能量代谢和氨基酸代谢（图5E）。
使用皮尔森相关系数分析得到核心代谢物网络（图6A-B）后发现，与对照组相比，模型组的核心代谢物与能量代谢和鞘脂代谢密切相关。乳酸和脂质代谢相关的代谢物明显上调，而支链氨基酸明显下调，这表明LPS诱导的ALI导致了快速但低效的能量代谢，而HLD可以缓解ALI大鼠的代谢重编程和能量代谢（图6C）。
通过对转录组和代谢组数据的整合分析，作者发现明鞘脂代谢在ALI中起重要作用（图6D），详细的途径如图6E所示，在HLD干预下鞘氨醇（Cer）增加。此外，参与Cer生成的关键酶鞘磷脂合成酶和Cer合成酶编码基因的表达也受到抑制。
上述结果表明表明，HLD通过逆转参与鞘脂代谢的代谢物和基因的变化来改善ALI引起的代谢紊乱。
图5 HLD处理ALI大鼠的代谢组分析
图6 代谢网络和多组学联合分析
- HLD通过激活鞘脂通路缓解ALI
为了验证HLD对鞘磷脂途径的调节，作者评估了肺组织中Cer的水平。Cer是鞘磷脂途径中最关键的代谢物，其含量的变化影响到炎症的严重程度。ELISA结果显示，LPS增加了组织中Cer的含量，而HLD明显抑制了LPS引起的Cer的变化（图7B）。此外，ASAH1在体内介导Cer的降解。免疫组化染色结果表明，HLD上调了ASAH1的表达（图7A），这表明HLD阻止了体内Cer的积累，随后通过上调ASAH1的表达缓解了ALI。
由于NLRP3炎性小体的异常激活或失调表现在最常见的炎症性疾病中，作者还检测了炎症因子的变化，正如预期的那样，LPS显著增加了ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表达，这种变化被HLD预处理显著抑制（图7C-D）。
图7 HLD通过激活鞘脂信号通路在ALI治疗中起作用
- ASAH1抑制剂降低了HLD对ALI的保护作用
为了进一步证实鞘脂信号通路是HLD治疗ALI的主要途径，作者采用新的验证队列测试了ASAH1抑制剂Carmofur的作用，新的大鼠队列被设置为对照组Con，模型组LPS，治疗组HLD和抑制剂组LPS+HLD+Carmofur。HE染色结果证明，Carmofur降低了HLD的治疗效果，ASAH1、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的相对mRNA表达也相应变化（图8B-E）。免疫组织化学染色结果显示，HLD明显增加了ASAH1的表达，降低了NLRP3和IL-1β的水平（图8G-J），此外，HLD还上调了ASAH1的mRNA表达，并下调了NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达，然而，这些作用在LPS+HLD+Carmofur大鼠中被中和。
这些结果表明，抑制剂Carmofur干扰了HLD治疗ALI的效果，表明鞘磷脂途径可能是HLD缓解ALI引起的炎症的主要信号途径。
图8 ASAH1活性的抑制抵消了HLD对ALI的保护作用
【小结】
在这项研究中，作者综合药理学揭示了HLD缓解ALI的药理作用和分子机制。HLD能够调节脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢等多种代谢途径，重塑机体代谢平衡，并通过激活鞘脂途径抑制NLRP3炎症小体及其下游事件的激活，改善ALI炎症。该研究从整体上较好地解释了HLD改善ALI的机制基础，为进一步研究复方中药系统对ALI的作用提供了参考。返回搜狐，查看更多
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