李剑超 陕西师范大学

荧光共振能量转移（FRET）是一种基于距离的光谱技术，可以用于研究生物分子的结构和动力学，以及开发新型的传感和成像方法。FRET的原理是，当两个荧光基团（供体和受体）的发射和吸收光谱有重叠时，供体在激发后可以将能量非辐射地转移给受体，从而改变两者的荧光强度和寿命。FRET的效率取决于两个荧光基团之间的距离，通常在1-10 nm范围内。因此，FRET可以作为一种分子尺，测量荧光基团之间的相对距离变化，从而反映生物分子的构象变化或相互作用。

在本文中，我们将介绍一些使用有机染料、阳离子聚合物和碳基淬火剂作为荧光基团的多路复用技术，以及它们在生物分析和纳米技术领域的应用。多路复用技术是指同时检测多个目标或事件的能力，通常通过使用不同的荧光基团或不同的FRET效率来实现。多路复用技术可以提高检测的灵敏度和特异性，以及降低样品消耗和实验时间。

有机染料

有机染料是一类合成的有机分子，具有较高的荧光量子产率和光稳定性，可以用于标记各种生物分子，如蛋白质和核酸。有机染料的优点是，它们有很多种类，覆盖了从紫外到红外的广泛的光谱范围，可以通过化学修饰或生物共轭方法与目标分子连接。有机染料也是目前FRET实验中最常用的荧光基团，因为它们可以方便地选择合适的供体和受体对，以实现最佳的FRET效率。

有机染料可以用于实现多重FRET，即同时进行多个FRET过程，以检测多个目标或事件。有两种主要的多重FRET策略：FRET级联和多色FRET条形码。

FRET级联

FRET级联是指在多个荧光基团之间发生连续的FRET过程，从而形成一个能量转移的链条。FRET级联的原理是，一个或多个供体荧光团被激发后，将能量转移给相邻的受体荧光团，然后受体荧光团再将能量转移给下一个受体荧光团，依此类推，直到最后一个受体荧光团发射荧光。FRET级联的优点是，它可以使用单一的激发波长，同时产生多个不同的发射波长，从而实现多重检测。

FRET级联已经被用于开发多重传感器和光子器件。例如，Li等人利用四种具有光谱重叠的染料（FAM，TAMRA，ROX和Cy5），构建了一种多重级联传感器，可以同时检测三种不同的DNA靶标。他们将每种染料分别标记在三条互补的DNA探针上，以形成一个FRET级联系统。当没有靶标存在时，只有FAM发射荧光，因为其他染料被猝灭。当三种靶标分别与对应的探针杂交时，FRET级联被打开，导致TAMRA，ROX和Cy5依次发射荧光。通过测量四种染料的荧光信号，可以实现对三种靶标的同时检测。

FRET级联也被用于创建潜在的光子电路板器件，即利用光信号来控制信息的流动和处理。例如，Stein等人使用三种不同的染料（ATTO488，ATTO565和ATTO647N）标记在DNA折纸平台上，以实现两种不同的FRET级联路径。他们通过改变中间染料（ATTO565）的位置，来切换能量转移的路径，从而产生不同的FRET信号。这种方法可以用于模拟光子器件中的逻辑门和开关，以实现光信号的控制和处理。

多色FRET条形码

多色FRET条形码是指使用多个荧光基团标记或封装在纳米或微粒上，以产生不同的FRET信号，从而实现多重检测。多色FRET条形码的原理是，每个纳米或微粒上的荧光基团组合和比例都是独特的，可以作为一个条形码来区分不同的目标或事件。多色FRET条形码的优点是，它们可以提高检测的灵敏度和特异性，以及降低样品消耗和实验时间。

多色FRET条形码已经被用于实现多重成像和药物递送。例如，Wagh等人开发了一种聚合物纳米颗粒，该聚合物纳米颗粒封装了四种不同的碳花青基染料（CF，CP，CR和CIR），以实现双，三和四荧光团FRET。他们通过调整每种染料的组合和浓度，生成了不同的FRET条形码，可以用于体外和体内的多重成像，具有单波长激发。除了多重成像外，这些染料负载的纳米颗粒还可以通过封装适配体结合的抗癌药物来用于可追溯的药物递送系统。因此，通过使用多种适配体-药物复合物以及各种组合和浓度的荧光基团，它们在靶向递送和多重方面具有巨大的潜力。

多色FRET条形码也被用于研究生物分子的多组分动力学，即同时监测生物分子的不同区域或不同生物分子之间的相互作用。例如，使用单个供体和两个或多个受体标记在生物分子上，已经确定了复杂的生物分子相互作用[3,44]。例如，Yoo等人使用交替的激光激发和寿命测量，研究了一种蛋白质的快速折叠动力学，该蛋白质用一个供体（Alexa 488）和两个受体（Alexa 555和Alexa 647）标记其不同的结构域。他们通过测量两个FRET效率，可以区分出蛋白质的三种不同构象状态，从而揭示了蛋白质折叠的分子机制。类似地，Barth等人使用三色光子分布分析，结合基于扩散的三色FRET实验，来测量Hsp70伴侣BiP不同结构域之间的距离，成功地可视化了其构象变化。他们使用一个供体（Alexa 488）和两个受体（Alexa 568和Alexa 647）标记在BiP的三个不同结构域上，以实现三色FRET。通过分析三色FRET信号，他们可以获得BiP的三个结构域之间的两个距离，从而揭示了BiP的构象动力学。

尽管多色FRET系统具有多种优点，但这些系统的一个主要缺点是仪器成本和数据分析的复杂性，特别是对于传感和成像应用。这是因为这些系统通常需要多个激发源和多个发射波长的处理，这需要使用技术上复杂且成本高昂的高端仪器。近年来，出现了一些替代方法来解决这些局限性。例如，调整单个供体和受体之间的FRET距离已被证明可以提供不同的FRET效率值，这些值可用于区分所研究的同一系统中发生的不同事件。例如，原始的DNA-PAINT [6]和Exchange-PAINT 技术需要多个激发源，因为它们利用多个荧光团标记和顺序成像，这阻碍了实验的通量。Deußner-Helfmann等人利用FRET的距离依赖性提供了另一种方法。他们使用两条成像链将相关的单分子FRET扩展为DNA-PAINT，每条成像链都用供体或受体荧光团标记（图2b）。每条成像链被设计为在与对接链结合时产生不同的FRET效率，具体取决于荧光团的序列和标记位置。在这项研究中，可以将FRET值分配给特定靶标，这提供了一种使用单个供体-受体对对DNA-PAINT进行多重分析的方法。同样，使用多荧光团平台（如天线或剩余系统）进行多路复用传感也很有前途，但这些技术涉及复杂的数据分析程序。Kaur等人最近开发了一种基于FRET的多重分析平台，用于仅使用单个供体-受体对检测未标记的DNA序列（图2c）。通过调整 i nterconvertible Hairpin-b ased s ensors （iHabSs） 的染料间距离，可以同时检测三种不同的 DNA 靶标。在该策略中，使用三个 iHabS（每个 iHabS 包含一个发夹部分，两侧有不同长度的 ssDNA 间隔区）来调整 iHabS 特异性 FRET 效率。每个发夹序列的很大一部分被设计为与特定的DNA探针部分杂交，以在没有靶标的情况下使iHabSs保持在低FRET状态。靶标的存在通过脚趾介导的相应探针位移诱导 DNA 发夹的形成，使供体-受体对更紧密地靠在一起，提供 iHabS 特异性 FRET值。证明了三种光谱可分辨的FRET效率，有可能同时检测多达六个目标。该检测平台的主要优点是，无论传感器在载玻片表面上的位置如何，都可以通过传感器特定的FRET效率实现多重检测。

阳离子聚合物

阳离子聚合物是一类带正电荷的共轭聚合物，具有较高的荧光量子产率和光稳定性，可以用于与带负电荷的生物分子，如DNA和RNA，形成静电复合物。阳离子聚合物的优点是，它们可以作为高效的荧光供体，与多种有机染料受体形成FRET，从而实现多重检测。阳离子聚合物也是一种环境敏感的荧光材料，因为它们的荧光强度和寿命会随着溶液的pH值，温度，离子强度和氧气浓度而变化。

阳离子聚合物已经被用于开发多重FRET传感器，以检测DNA突变[1]、microRNA和蛋白质活性。这些传感器的一般原理是，使用荧光团标记的DNA探针与阳离子聚合物形成静电复合物，从而产生FRET，当靶标分子与DNA探针发生相互作用时，FRET信号发生变化，从而实现检测。通过使用不同的荧光团标记的DNA探针，可以实现对多个靶标的同时检测。

DNA突变检测

DNA突变是指DNA序列中的单个或多个碱基的改变，可能导致遗传疾病或癌症的发生。因此，检测DNA突变对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。阳离子聚合物已经被用于开发多重FRET传感器，以检测DNA突变。例如，Zhang等人使用阳离子聚合物（PFP）和两种不同的染料（FAM和Cy5）标记的DNA探针，构建了一种多重FRET传感器，可以同时检测两种不同的DNA突变。他们将每种染料分别标记在两条互补的DNA探针上，以形成一个FRET系统。当没有靶标存在时，PFP和FAM之间发生FRET，而FAM和Cy5之间没有FRET。当两种靶标分别与对应的探针杂交时，PFP和FAM之间的FRET被抑制，而FAM和Cy5之间的FRET被增强。通过测量PFP，FAM和Cy5的荧光信号，可以实现对两种靶标的同时检测。

microRNA检测

microRNA是一类长度约为22个碱基的小非编码RNA，可以通过与靶mRNA的部分互补来调节基因表达。microRNA在许多生物过程中发挥重要作用，如细胞分化、增殖、凋亡和代谢，以及与许多疾病的发生和发展相关。因此，检测microRNA对于研究其生物功能和临床诊断具有重要意义。阳离子聚合物已经被用于开发多重FRET传感器，以检测microRNA。例如，周等人使用阳离子聚合物（PFP）和两种不同的染料（FAM和Cy3）标记的DNA探针，构建了一种多重FRET传感器，可以同时检测两种不同的microRNA序列。他们将每种染料分别标记在两条互补的DNA探针上，以形成一个FRET系统。当没有microRNA存在时，PFP和FAM之间发生FRET，而FAM和Cy3之间没有FRET。当两种microRNA分别与对应的探针杂交时，PFP和FAM之间的FRET被抑制，而FAM和Cy3之间的FRET被增强。通过测量PFP，FAM和Cy3的荧光信号，可以实现对两种microRNA的同时检测。

蛋白质活性检测

蛋白质活性是指蛋白质执行其生物功能的能力，通常与蛋白质的结构和构象变化有关。蛋白质活性的检测对于理解蛋白质的作用机制和筛选潜在的药物靶标具有重要意义。阳离子聚合物已经被用于开发多重FRET传感器，以检测蛋白质活性。例如，Wang等人使用阳离子聚合物（PFP）和两种不同的染料（FAM和Cy5）标记的肽探针，构建了一种多重FRET传感器，可以同时检测两种不同的蛋白酶的活性。他们将每种染料分别标记在两条含有蛋白酶切割位点的肽探针上，以形成一个FRET系统。当没有蛋白酶存在时，PFP和FAM之间发生FRET，而FAM和Cy5之间没有FRET。当两种蛋白酶分别切割对应的肽探针时，PFP和FAM之间的FRET被抑制，而FAM和Cy5之间的FRET被增强。通过测量PFP，FAM和Cy5的荧光信号，可以实现对两种蛋白酶活性的同时检测。返回搜狐，查看更多